РЕХАБИЛИТАЦИЈА НА АУТИЗМОТ СО ИМУНО-МОДУЛАЦИСКА ТЕРАПИЈА

Вијендра К. СИНГ

Оддел за биологија и Центар за интегрирани биосистеми, Државен универзитет на Јута, Логан, Јута 84322, САД

REHABILITATION OF AUTISM WITH IMMUNE MODULATION THERAPY

Vijendra K. SINGH

Department of Biology and Center for Integrated Biosystems, Utah State University, Logan, Utah 84322, USA

Вовед

Introduction

Аутизмот е биолошко нарушување што ја оштетува функцијата на централниот нервен систем (ЦНС). Тој манифестира разурнувачки невролошки, како и психијатриски резултати кај заболеното лице. Дијагнозата се прави раното детство, пред возраст од 34 месеци, но неволјата продолжува до зрела возраст, станувајќи доживотна пречка (инвалидност). Во последно време аутизмот не се дефинира според етиологијата или патологијата, туку според присуството на посебен модел на карактеристики на владеења што следат посебен развоен тек со индикација за одложување или девијантен развој во првите три години од животот. Аутистичните владеења што го карактеризираат нарушувањето, вклучуваат “квалитативни дефицити" во четири главни категории: дефицити на развојните стапки и/или секвенци и дефицити на реакција на сензорните стимуланси; дефицити на говор, јазик и когнитивен капацитет; како и дефицити на социјални интеракции или начини во однос со другите луѓе. До неодамна зачестеноста на аутизмот беше 4-5 на секои 10.000 раѓања, но бројот на аутистичните случаи нагло расте (1). Денес се верува дека аутизмот е најбрзо растечка развојна пречка кај децата со пресметана зачестеност од 1 во 125 до 1 во 500 раѓања.
Аутизмот е најпроминентно мозочно нарушување од целиот спектар на аутистични нарушувања (САН) што вклучува група на развојни нарушувања. Тоа е комплексно и хетерогено нарушување. Многукратни фактори може да бидат инволвирани во патогенезата на нарушувањето (2, 3). Иако нема некој ген идентификуван специфично за аутизмот, десет или повеќе гени се пресметани и посочени за спектарот на аутистичните нарушувања (4). Иако барањето на генетските фактори се фаворизира, се очекува дека генетските фактори покриваат не повеќе од 10% кај аутистичната популација; другите 90% на аутистичната популација се објаснува со негенетски фактори. Тие вклучуват фактори на средината, имунофакторите, неврохемиските фактори и други, сé уште, непознати фактори. Пред неколку години ние имавме хипотези дека имуно-активацијата води кон автоимунитет и инфламацијата на мозокот што може да одигра важна улога во патогенезата на аутизмот (5). А сега инфламацијата на мозокот е најдена и кај аутизмот (6). Овој научен напис ги опишува истражувачките развои што може да се користат за рехабилитација на аутизмот со имуно-модулациска терапија (ИМТ).

Autism is a biological disorder that impairs the function of the central nervous system (CNS). It manifests devastating neurological as well as psychiatric outcomes in the affected individual. The diagnosis is made during early childhood before the age of 34 months but the affliction continues well into the adulthood, becoming a life-long disability. Currently, autism is defined not by etiology or pathology but by the presence of a particular pattern of behavioral characteristics that follow a particular developmental course with evidence of delay or deviant development within the first three years of life. Autistic behaviors that characterize the disorder include “qualitative deficits” in four main categories: deficits of developmental rates and/or sequences; deficits of responses to sensory stimuli; deficits of speech, language, and cognitive capacity; and deficits of social interactions or ways in relating to other people. Until recently, the incidence of autism was 4-5 in every 10,000 births but the number of autistic cases is rising sharply (1). Today, autism is believed to be the fastest growing developmental disability in children with an estimated incidence of 1 in 125 to 1 in 500 births.
Autism is the most prominent brain disorder of all autistic spectrum disorders (ASD) that include a group of developmental disorders. It is a complex and heterogeneous disorder. Multiple factors might be involved in the pathogenesis of the disorder (2, 3). While no single gene has been identified specifically for autism, an estimated ten or more genes have been proposed for autistic spectrum disorders (4). While the search for genetic factors is favored, genetic factors are expected to account for no more than 10% of the autistic population; the remainder 90% of the autistic population will be explained by non-genetic factors. They include environmental factors, immune factors, neurochemical factors and other as yet unknown factors. Several years ago, we hypothesized that immune activation leading to autoimmunity and inflammation in the brain may play an important role in the pathogenesis of autism (5). And now the inflammation of the brain has been found in autism (6). The present scientific article describes research developments that can be used to rehabilitate autism with immune modulation therapy (IMT). 

Автоимуна теорија за аутизмот

Autoimmune Theory for Autism      

Аутизмот е многу комплексно невролошко нарушување. Ние аутизмот го проучувавме како едно автоимуно нарушување, каде што вирусно-автоимуните интеракции може да водат кон патолошки промени во ЦНС. Шпекулиравме дека една вирусно предизвикана автоимуна реакција на миелинот на мозокот во развој може да го оштети анатомскиот развој на нервните патишта кај децата со аутизам (5). Ова е многу важно кај мозокот во развој едноставно бидејќи брзината на трансмисијата на нервниот импулс битно зависи од структурните особини на изолирањето на миелинската обвивка, поврзувајќи ги нервните влакна и дијаметралната оска. Накусо, направивме хипотеза дека една автоимуна реакција на мозочните структури, особено на миелинската обвивка, има критична улога во предизвикувањето на невролошките оштетувања кај пациенти со аутизам. Поставивме дека едно имуно оштетување по природната инфекција или вакцинација може да предизвика “засеци" или мали промени кај миелинската обвивка. Овие анатомски промени може ултимативно да водат кон доживотни нарушувања на повисоки ментални функции, како што се учењето, паметењето, комуникацијата, социјална интеракција итн. Идентификувавме некои вирусни, неврални и автоимуни фактори што нé водеа да развиеме спекулативен “невроавтоимунитетен модел на аутизмот", кој неодамна беше објавен  (3, 7). Сметаме дека аутизмот може успешно да се третира користејќи некои од терапиите што се покажаа ефикасни при лекување на други автоимуни болести. Кон ова, меѓутоа, комплетната идентификација и карактеризација на автоимуната патологија кај аутизмот е од најголем важност денеска.

Autism is a very complex neurological disorder. We studied autism as an autoimmune disorder, in which viral-autoimmune interactions may lead to pathological changes in the CNS. We speculated that a virus-induced autoimmune response to developing brain myelin may impair anatomical development of neural pathways in autistic children (5). This is very important in the developing brain simply because the speed of nerve-impulse transmission depends essentially on structural properties of the insulating myelin sheath, connecting nerve fibers, and axon diameter. Briefly, we hypothesized that an autoimmune reaction to brain structures, in particular myelin sheath, plays a critical role in causing neurological impairments in patients with autism. We postulated that an immune insult after a natural infection or vaccination might cause "nicks" or small changes in the myelin sheath. These anatomical changes could ultimately lead to life-long disturbances of higher mental function such as learning, memory, communication, social interaction, etc. We have identified certain viral, neural, and autoimmune factors that led us to develop a speculative “Neuroautoimmunity Model of Autism” that was recently published (3, 7). We think that autism can be treated successfully using some of the therapies proven effective in treating other autoimmune diseases. To that end, however, the complete identification and characterization of autoimmune pathology in autism is of utmost importance today.

Автоимуна хипотеза кај аутизмот
Фактори на средината (вирус) à Погрешно имуно регулирање à Автоимунитет на мозокотà
Аутизам

Autoimmune Hypothesis in Autism
Environmental Factors (virus) à
Faulty Immune Regulation à
Autoimmunity to Brain à
Autism

Автоимунитетот се мисли дека е “срж" на проблемот кај аутизмот.  Автоимунитетот е абнормална имунореакција, во која имунолошкиот систем станува главен во реакцијата против органите на телото, а вистинскиот резултат е автоимуна болест. Клиничката презентација на автоимуните болести опфаќа неколку фактори: фактори на средината, генетската поврзаност особено на гените за имунолошкиот одговор, имуноабнормалностите на имунорегулаторните Т-клетки што потекнуваат од тимусот, автоантителата, особено органско специфични автоантитела, факторот на полот за поголема зачестеност кај машкиот или кај женскиот пол, хормонските фактори и реакцијата на имуномодулациската терапија (2, 3). Вирусите се сметаат за активирачки поттикнувачи на автоимуните болести, кои општо се поврзуваат со ИР-гените, на пример: ХЛА-алелите, хаплотипите или Гм-изотиповите, лоцирани на хромозомот 6 кај мажите. Како што е изложено во Табела 1, многу од овие параметри се идентификувани сега кај децата со аутизам.

Autoimmunity appears to be the “core” of the problem in autism. Autoimmunity is an abnormal immune reaction in which the immune system becomes primed to react against body organs, and the net result is an autoimmune disease. The clinical presentation of autoimmune diseases involves several factors: environmental factors, genetic link especially of immune response (IR) genes, immune abnormalities of thymus-derived immunoregulatory T cells, autoantibodies especially organ-specific autoantibodies, gender factor for greater prevalence in males or females, hormonal factors, and response to immune modulation therapy (2, 3). Viruses are commonly considered as trigger agents for autoimmune diseases, which are generally linked to IR genes, for example HLA allele, haplotypes or Gm isotypes, located on chromosome 6 in man. As summarized in Table 1, many of these parameters have now been identified in autistic children.

Табела 1. Автоимуни абнормалности кај аутизмот

Table 1. Autoimmune Abnormalities in Autism

• Аутизмот покажува микробиолошки поврзаности на некои вируси, како што се морбилите (8, 9), рубеолата (10) и ЦМВ (11, 12).
• Аутизмот покажува зголемена фреквентност на генетски одговори за имунолошкиот одговор, на пример: HLA-антигени, C4B-нултиот алел, хаплотипот B44-SC30-DR4, HLA-C и HLA-B1 (13-15).
• Аутистичните пациенти имаат оштетувања на целуларниот и хуморалниот имунитет: намалување на IgA; зголемување на IgG3, антинуклеарни антитела и имунокомплекси; намалување бројот на лимфоцитите, CD4 + T-клетки што помагаат и клетки-природни убијци (КПУ); задушен целуларен имунитет како реакција на намалена митогено предизвикана лимфоцитна стимулација и намалена КПУ-клеточна активност (16-19).
• Decata со аутизам покажуваат несоодветна имунореакција на основниот протеин на миелинот (20) и вакцината против морбили-заушки-рубеола (МПР) (21).
• Аутизмот го опфаќа факторот на полот и машкиот пол заболува четири пати повеќе одошто женскиот (3).
• Аутизмот често се јавува во врска со семејната историја на автоимуни болести, на пример: повеќекратна склероза, ревматоиден артритис, тип II дијабетес (22).
• Аутизмот, исто така, ги опфаќа и хормоналните фактори, на пример: секретин, бета-ендорфин и така натаму (2).
• Аутистичните пациенти имаат органско специфични автоантитела за мозочните антигени, како што се миелин базичниот протеин на (МБП) (3, 5), неврон-аксон филаментозни протеини (НАФП) (3, 23), протеините на серотонин-рецепторот (24), галактоцереброзидите (3) и протеините на nucleus caudatus (25).
• Аутистичните пациенти покажуваат имуноактивација како реакција на Т-клеточната   активација   (26, 27),  покачување на автоимунитетските специфични цитокини (7, 28) и инфламација на мозокот (6).
• Аутистичните пациенти добро реагираат на автоимуната терапија со орални автоантигени (3), трансфер-фактор што потекнува од леукоцитите (29) и интравенозните имуноглобулини (19).

• Autism shows microbial associations of certain viruses such as measles (8, 9), rubella (10) and CMV (11, 12).
• Autism displays increased frequency of immune response (IR) genes, for example HLA antigens, C4B null allele, haplotype B44-SC30-DR4, HLA-C and HLA-B1 (13-15).
• Autistic patients have impairments of cellular and humoral immunity: decrease of IgA; increase of IgG3, antinuclear antibodies and immune complexes; decrease of lymphocyte count, CD4+ T helper cells and natural killer (NK) cells; and suppressed cellular immunity as reflected by decreased mitogen-induced lymphocyte stimulation and reduced NK cell activity (16-19).
• Autistic children show inappropriate immune reaction to myelin basic protein (20) and measles-mumps-rubella (MMR) vaccine (21).
• Autism involves a gender factor affecting males about four times more than females (3).
• Autism often occurs in conjunction with a family history of autoimmune diseases, for example, multiple sclerosis, rheumatoid, type II diabetes and arthritis (22).
• Autism also involves hormonal factors, e.g., secretin, beta-endorphin, etc. (2).
• Autistic patients have organ-specific autoantibodies to brain antigens such as myelin basic protein (MBP) (3, 5), neuron-axon filament proteins (NAFP) (3, 23), serotonin receptor proteins (24), galactocerebrosides (3), and caudate nucleus proteins (25).
• Autistic patients show immune activation as reflected by T cell activation (26, 27),  elevationof autoimmunity-specific cytokines (7, 28) and inflammation of the brain (6).
• Autistic patients respond well to autoimmune therapy with oral autoantigen (3), leukocyte-derived transfer factor (29) and intravenous immunoglobulin (19).

Кај автоимуната патологија, една од истакнатите карактеристики, се органско-специфичните автоантитела. Во случајот на аутизам, тие ќе бидат мозочно-специфични автоантитела. Секако, значителен број на децата со аутизам имаат автоантитела за неколку мозочни антигени. Од сите испитани мозочни автоантигени, најзачестено се јавува МБП на миелинската обвивка, што сугерираше  да заклучиме дека автоимуната реакција кон МБП се јавува кај аутизмот (3, 5). Иако не е познат прецизниот активирачки механизам за автоимунитетот. Ние истражувавме две можности: (I) вирусно предизвикана автоимуна реакција и (II) автоимуна реакција предизвикана од жива. Неодамна изведовме серолошка студија за вирусни антитела и антитела предизвикани од жива. Најпрвин ја измеривме вирусната серологија кај вирусот на морбилите (ВМ), вирусот на заушките (ВЗ), вирусот на рубеолата (ВР), цитомегаловирусот (ЦМВ) и човечкиот вирус на херпесот-6 (ЧВХ-6). Откривме дека децата со аутизам имаат значително повисоки од нормалните нивоа на антитела само кај вирусот на морбилите, но нивото на антителата кај другите четири вируси значително не се разликуваа меѓу децата со аутизам и нормалните деца. Според тоа, сугериравме дека инфекцијата од морбилите би можела етиолошки да се поврзе со автоимунитетот кај аутизмот (3, 9). Второ, бидејќи аутизмот и изложувањето на жива може да го опфатат и автоимунитетот, живата делумно се смета како ризичен фактор кај аутизмот. Така, поставивме хипотеза дека ако аутизмот опфаќа врска меѓу изложувањето на жива и автоимунитетот, тогаш децата  со   аутизам   би  требало  да  имаат

For autoimmune pathology, one of the salient features is the organ-specific autoantibodies. In case of autism, they would be brain-specific autoantibodies. Indeed, a significant number of autistic children harbor autoantibodies to several brain antigens. Of all the brain autoantigens tested, the most common one appears to be the MBP of the myelin sheath, which led us to postulate that an autoimmune response to MBP is involved in autism (3, 5). Although the precise trigger mechanism for autoimmunity is not known we investigated two possibilities: (I) virus-induced autoimmune reaction, and (II) mercury-induced autoimmune reaction. We recently conducted serological study of viral antibodies and mercury-induced antibodies.  First, we measured virus serology to measles virus (MV), mumps virus (MuV), rubella virus (RV), cytomegalovirus (CMV), and human herpesvirus-6 (HHV-6). We found that autistic children harbored significantly higher than normal levels of antibodies to measles virus only, but the level of antibodies to other four viruses did not significantly differ between autistic and normal children. Accordingly, we postulated that a measles infection might etiologically be linked to autoimmunity in autism (3, 9). Secondly, because both autism and mercury exposure could involve autoimmunity, mercury has been anecdotally proposed as a risk factor in autism. So, we hypothesized that if autism involved a connection between mercury exposure and autoimmunity  then  autistic  children  should harbor elevated levels of mercury-induced autoimmune markers, namely the antinucleolar antibodies and antilaminin antibodies. We recently conducted a laboratory study of these two autoimmune markers in autistic children and normal children and the results of this study showed that the distribution of these two markers did not change in autistic children.
Thus mercury does not appear to be a risk factor for autoimmunity in autism (30). Furthermore, we found that a vast majority of autistic children showed a serological association between measles virus and MBP autoantibodies, i.e., the higher the measles virus antibody level the greater the chance of MBP autoantibody. But this association was not found for other viruses and/or other brain autoantibodies that we studied. Clearly, this is an experimental evidence for an etiological link of measles virus to autoimmunity in autism (3, 8, 9).
The source of measles virus in autistic children is not well known. Because they do not have a history of a German measles rash hence a wild type measles infection is rather unlikely. But there exists a possibility of an “atypical or asymptomatic” measles infection in the absence of a typical measles rash. Such an infection could occur either by a variant measles infection or it could be acquired from immunization with MMR vaccine. An atypical measles infection in the absence of a rash and unusual neurological symptoms has recently been described to suggest the existence of a variant measles virus in man (31). In our own laboratory, we have recently gathered experimental evidence that shows that many autistic children have abnormal or inappropriate antibodies to MMR vaccine, but not to other vaccines like diptheria-tetanus-pertussis (DPT) or diptheria-tetanus (DT). And these antibodies were specifically directed against the measles subunit of the MMR vaccine (9, 21). Moreover, there was a strong serological correlation between MMR antibodies and MBP autoantibodies, suggesting a causal association of MMR vaccine with autism or autistic regression that has been described after the MMR immunization in children (21). While more research is necessary on this topic, we speculate that an atypical measles infection
may etiologically be linked to brain autoimmunity in autism. In this respect, other studies of autoimmunity-producing cytokines are also quite relevant: (1.) autistic children have significant increases of autoimmunity-inducing cytokines such as interleukin-12 (IL-12) and interferon-gamma (IFN-gamma) in favor of a Th-1 immune response (7, 28); and (2.) measles vaccination with MMR vaccine mainly induces IFN-gamma for Th-1 type of immune response (32). This finding could indirectly explain a causal link between MMR and autism (9, 21). Clearly, these findings are important for understanding the basic mechanism of autoimmunity in autism but more research is needed to understand their precise role in the pathogenesis of the disorder.

повисоки нивоа на автоимуни маркери предизвикани од жива, имено, антинуклеоларните антитела и антиламинински антитела. Неодамна изведовме лабораториска студија на овие два автоимуни маркера кај децата со аутизам и нормалните деца. Резултатите од оваа студија покажаа дека дистрибуцијата на овие два маркера не се смени кај децата со аутизам.
Така, живата не се јави како ризичен фактор за автоимунитетот кај аутизмот (30). Понатаму, откривме дека огромен број deca со аутизам покажаа серолошка поврзаност меѓу вирусот на морбилите и МБП-антитела, т.е. колку што е повисоко нивото на антителата кај вирусот на морбили, толку е поголема и промената на МБП-антителата. Но, оваа поврзаност не беше откриена кај другите вируси и/или другите мозочни автоантитела што ги проучувавме. Јасно е дека ова е експериментен доказ за етиолошката поврзаност кај вирусот на морбили со автоимунитетот кај аутизмот (3, 8, 9).
Изворот на вирусот на морбилите кај децата со аутизам не е добро познат. Бидејќи тие немаат историја за исипување на германските морбили, оттука не е веројатна инфекцијата на морбили од бурен тип. Сепак, има можност од појава на “атипична или асимптоматична" инфекција на морбили во отсуство на типичното исипување на морбилите. Таквата инфекција би можела да се јави или од варијатна инфекција на морбили или би можеле да се добие од имунизација со МПР-вакцина. Една атипична инфекција на морбили во отсуство на исипување и невообичаени невролошки симптоми неодамна беа опишани и сугерираа присуство на варијантен вирус на морбилите кај мажи (31). Во нашата лабораторија неодамна собравме експериментен доказ кој потврдува дека многу деца со аутизам имаат абнормални или несоодветни антитела на МПР-вакцината, но не и за другите вакцини, како што е дифтерија-тетанус-пертусис (ДТП) или дифтерија-тетанус (ДТ). И овие антитела беа особено против подгрупата на морбилите на МПР-

вакцината (9, 21). Уште повеќе, имаше силна серолошка корелација меѓу МПР-антителата и МБП-антителата, сугерирајќи случајна поврзаност на МПР-вакцината со аутизмот или со аутистичната регресија што се јавува по МПР-имунизацијата кај деца (21). Сепак, потребни се повеќе истражувања на оваа тема. Затоа размислуваме  дека  една  атипична  инфекција  на морбили може етиолошки да биде поврзана со мозочниот автоимунитет кај аутизмот. Во врска со ова, други студии за автоимунитетот што произведува цитокини, исто така, се релевантни: (1.) децата со аутизам имаат значително зголемување на автоимунитетот, што побудува цитокини, како што се интерлеукинот-12 (ИЛ-12) и интерферон-гама (ИФН-гама) во полза на Th-1 имунолошкиот одговор (7, 28); и (2.) вакцинацијата за морбили со МПР-вакцина главно поттикнува ИФН-гама за Тх-1 тип на имунореакцијата (32). Ова откритие би можело индиректно да ја објасни случајната врска меѓу МПР и аутизмот (9, 21). Јасно е дека овие откритија се важни за да се разбере основниот механизам на автоимуниетот кај аутизмот, но потребни се повеќе истражувања за да се разбере нивната прецизна улога кај патогенезата на ова нарушување.

Студии за цитокините
кај аутизмот

Cytokine Studies in Autism

Пред неколку години предложивме да ја проучуваме регулацијата на цитокините кај аутизмот, но поради недостиг од финансиска поддршка не бевме во можност подетално да ја проучуваме оваа тема. Затоа, пак, реализиравме почетни студии и направивме некои клучни опсервации. Студиите за цитокините може да се изведат со три различни методи: (1.) Цитокините может да бидат измерени во биолошки флуиди, како што се серумот, плазмата или цереброспиналниот флуид, што претставува ендогено (или in vivo) произведени циркулирачки цитокини;

Several years ago, we propose to study cytokine regulation in autism but due to lack of funding support we have not been able to study this topic in a greater detail. But we have carried out initial studies and made some key observations. Cytokine studies can be performed by three different approaches: (1.) Cytokines can be measured in biological fluids such as serum, plasma or cerebrospinal fluid, which represents endogenously (or in vivo) produced circulating cytokines; (2.) Cytokine production can be studied by peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) after mitogen stimulation in vitro; and (3.) Cytokine-specific mRNA expression can be measured in PBMNC after mitogen stimulation. We initially took the first approach because it represents an in vivo state and measured circulating levels of cytokines in autistic children. We found that the serum level of only three cytokines (IL-2, IL-12 and IFN-gamma) was significantly elevated in autistic children but the serum level of six other cytokines (IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-alpha and TNF-alpha) did not significantly differ between normal children and autistic children (7, 26, 28). Because of a specific increase of IL-12 and IFN-gamma, we suggested that autism involves Th-1 immune response (7, 28). Subsequently, we conducted a study of IL-2, IL-6 and TNF production by PBMNC. We found that the IL-2 production was significantly increased in autistic children. The production of IL-6 and TNF by PBMNC of autistic children was moderately higher in autistic children than the normal children but the difference did not attain statistical significance (7). Our result of TNF production in autistic children is consistent with a previous report (33). Recently, two other groups of researchers took alternative approaches and found that PBMNC of autistic children produce elevated levels of IL-12 and IFN-gamma or express higher than normal levels of mRNA for IFN-gamma (for citations see ref. "7). Taken together, these findings demonstrate the existence of Th-1 type of the immune response in autistic children and that would also be consistent with autoimmune pathology in autism because the IL-2, IL-12 and IFN-gamma cytokines are well known inducers of autoimmune diseases (34).
Regarding the pathogenesis of immune-mediated diseases, immune activation is one of the primary events in autoimmunity, inflammation and viral infections. Immune activation leads to spontaneous proliferation of peripheral blood mononuclear cells, increased expression of activation markers on peripheral blood mononuclear cells, and increased accumulation of blood mononuclear cell-derived soluble antigens, mainly cytokines, cytokine receptors, and adhesion molecules. Based on these considerations, immune activation occurs naturally in autistic children because they have elevated levels of immune activation antigens such as sCD8, IL-2, IL-12 and IFN-gamma (26, 28) and their blood contains activated T cells (26, 27). Thus it is reasonable to conclude that the increase of IL-12 in autistic children points to antigenic stimulation of Th-1 cells, which via INF-gamma may induce autoimmunity (7). The IL-12 cytokine selectively promotes the development of Th-1 cells (35) and Th-1 cells initiate the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases (34). 

(2.) Производството на цитокините може да се проучува преку периферните крвни мононуклеарни клетки (ПКМНК) по митогенска стимулација in vitro; и (3.) Цитокинското специфично иРНА изразување може да се мери со ПКМНК по митогенска стимулација. Ние на почетокот го зедовме првиот метод, бидејќи тој претставува in vivo состојба и ги измеривме циркулирачките нивоа на цитокините кај decata со аутизам. Откривме дека нивото на серумот на само три цитокини (ИЛ-2, ИЛ-12 и ИФН-гама) беше значително кренато кај децата со аутизам, а нивото на серумот на другите шест цитокини (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-алфа и ТНФ-алфа) значително не се разликуваа меѓу нормалните и децата со аутизам (7, 26, 28). Поради специфичното зголемување на ИЛ-12 и ИФН-гама сугериравме дека аутизмот ја опфаќа Th-1 имунолошкиот одговор (7, 28). Последователно, изведовме студија за производството на ИЛ-2, ИЛ-6 и ТНФ на ПКМНК. Откривме дека производството на ИЛ-2 беше значително зголемен кај децата со аутизам. Производството на ИЛ-6 и ТНФ на ПКМНК кај децата со аутизам беше умерено повисоко отколку кај нормалните деца, а разликата немаше никаква статистичка значајност (7). Нашиот резултат за производството на ТНФ кај децата со аутизам и еднаков на претходниот извештај (33). Наодамна две други групи истражувачи употребија алтернативни методи и открија дека ПКМНК кај децата со аутизам произведува покачено ниво на ИЛ-12 и ИФН-гама или изразува повисоки од нормални нивоа на иРНА за ИФН-гама (за цитирање видете во литература "7). Овие откритија го покажуваат постоењето на Th-1 типот на имунолошки одговор кај децата со аутизам и тоа, исто така, ќе биде еднакво со автоимуната патологогија кај аутизмот, бидејќи ИЛ-2, ИЛ-12 и ИФН-гама цитокините се добро познати поттикнувачи на автоимуните болести (34).
Во поглед на патогенезата на имунопосредуваните болести, имуноактивацијата е еден од примарните настани кај авто-
имунитетот,   инфламацијата  и  вирусните

инфекции. Имуноактивацијата води кон спонтана пролиферација на периферните крвни мононуклеарни клетки, зголемен израз на активациските маркери на периферните крвни мононуклеарни клетки и зголемена акумулација на растворливите антигени добиени од крвната мононуклеарна клетка, главно, цитокините, цитокинските рецептори и адхезивните молекули. Врз основа на овие размислувања, имуноактивацијата се јавува природно кај децата со аутизам, бидејќи тие имаат подигнати нивоа на имуноактивациски антигени, како што се: сЦД8, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИФН-гама (26, 28) и нивната крв содржи активирани Т клетки (26, 27). Така, разумно е да се заклучи дека зголемувањето на ИЛ-12 кај децата со аутизам укажува на антигенска стимулација на Th-1 клетките, кои виа ИНФ-гама може да поттикне автоимунитет (7). ИЛ-12 цитокинот селективно го помага развојот на Th-1 клетките (35) и Th-1 клетките иницираат патогеноза на органско специфичните автоимуни болести (34).

Тестирање на автоимунитетот
кај аутизмот

Testing for Autoimmunity in Autism

Неодамнешните откритија јасно покажуваат дека автоимунитетот има многу важна улога во патогенезата на невролошките нарушувања, вклучувајќи го аутизмот (2, 3). Бидејќи мозокот е заболениот орган, автоимуната реакција ќе биде против мозокот. Автоимунитетот обично се манифестира со извесни автоимуни фактори што ги идентификувавме кај деца со аутизам. Овие фактори се важни за да ја идентификуваат мозочно специфичната автоимуна реакција. Со испитување на крвта може да одредиме дали еден пациент покажува автоимунитет на мозокот, дали тој или таа е кандидат за експериментна имуномодулациска терапија, и дали реакцијата на терапијата е ефективна. Така, овој тип имуноевалуацијата е крајно важен за рехабилитација на пациенти со аутизам. Специфични тестови се наведени подолу:

Recent advances have clearly shown that autoimmunity plays a very important role in the pathogenesis of neurological disorders, including autism (2, 3). Since brain is the affected organ, the autoimmune response will be directed against the brain. Autoimmunity is commonly manifested by certain autoimmune factors that we have identified in children with autism. These factors are important for identifying a brain-specific autoimmune response. By performing blood tests we can determine if a patient shows autoimmunity to brain, if he or she is a candidate for experimental immune modulation therapy, and if the response to therapy is effective. Thus, this type of immune evaluation is extremely important in rehabbing patients with autism. The specific tests are listed below:

• Профил на мозочни автоантитела: Овој тест ги открива антителата кај два мозочни протеина-МБП и НАФП. Откривме дека МБП-антителото кај аутистичната популација е забележително повисоко отколку кај нормалната популација; оттука, тоа служи како примарен маркер на автоимуната реакција кај аутизмот. Спротивно на тоа, НАФП-антителото кај аутистичните пациенти е само маргинално пивисоко отколку нормалните контроли, правејќи го втор маркер за избор. Сепак, се препорачува овие два автоимуни маркера да се тестираат истовремено (3).
• Вирусно-серолошки профил: Овој тест го мери нивото на антитела во вирусите, како што се: морбилите, заушките, рубеолата, ЦМВ или ЧВХ-6. Прикажавме дека нивото на антителото кај морбилите е зголемено кај многу деца со аутизам. Тоа може да биде знак за инфекција, мината инфекција или имунореакција на МПР-вакцината (3, 9).
• Вакцино-серолошки профил: Овој тест ги открива антителата на вакцините, вклучувајќи ги МПР и ДТП. Покажавме дека значителен број деца со аутизам, но не и нормалните деца, задржуваат единствен тип антитело на морбили на МПР-вакцината. Ова антитело би можело да претставува абнормална или несоодветен имунолошки одговор  на оваа вакцина и би требало да се тестира во врска со автоимунитетот кај аутизмот (3, 21).
• Цитокински профил: Два цитокина-ИЛ-12 и ИФН-гама, имаат многу важна патогенетска улога кај автоимуните болести, односно тие иницираат автоимуна реакција преку поттикнување на Th-1 тип на белите крвни клетки. Откривме дека овие два цитокена селективно се подигнати кај decata со аутизам, што сугерира поттикнување на автоимунитетот преку Th1- клетките кај аутизмот. Затоа, тие треба да се мерат како знак за оштетен клеточен автоимунитет кај пациенти со аутизам (7, 28).
• Серотонински профил: Овој тест го мери нивото на серумот или плазмата на серотонинот. Откривме дека пациентите со аутизам имаат абнормално ниво на серотонин, што би требало да се тестира пред да се даде третманот со терапија на селективен серотонински инхибитор на повторно врување (ССРИ). Нивото на зголемениот серотонин кај аутизмот може, исто така, да биде поврзано со автоимуната реакција на серотонинските рецептори во мозокот (21).
• Автоимуни маркери поттикнати од жива: Овој тест ја анализира автоимуната реакција на изложување на жива (или тешки метали). Овие маркери опфаќаат нуклеарни антитела спроти нуклеарните антигени и антиламининските антитела спроти протеините на базалната мембрана. Откривме дека само мал број на деца со аутизам се позитивни на овие антитела, но нивото на овие антитела значително не се разликуваше од нормалните деца (30).

• Brain autoantibody profile: This test detects antibodies to two brain proteins, namely the MBP and NAFP. We have found that the incidence of MBP autoantibody in the autistic population is markedly higher than that of the normal population; hence, it serves as a primary marker of the autoimmune reaction in autism. In contrast, the incidence of NAFP antibody in autistic patients is only marginally higher than the normal controls, making it a secondary marker of choice. It is however recommended that these two autoimmune markers be tested simultaneously (3).
• Virus serology profile: This test measures level of antibodies to viruses such as measles, mumps, rubella, CMV or HHV-6. We have shown that the level of measles antibody is elevated in many autistic children, which could be a sign of a present infection, past infection, or immune reaction to MMR vaccine (3, 9).
• Vaccine serology profile: This test detects antibodies to vaccines, including MMR and DPT. We showed that a significant number of autistic children, but not the normal children, harbor a unique type of measles antibody to MMR vaccine. This antibody might represent an abnormal or inappropriate immune reaction to this vaccine and should be tested in relation to autoimmunity in autism (3, 21).
• Cytokine profile: Two cytokines namely IL-12 and IFN-gamma play a very important pathogenic role in autoimmune diseases, i.e., they initiate an autoimmune reaction via induction of Th-1 type of white blood cells. We have found that these two cytokines are selectively elevated in autistic children, suggesting the induction of autoimmunity via Th-1 cells in autism. Therefore they should be measured as a sign of impaired cellular autoimmunity in patients with autism (7, 28).
• Serotonin profile: This test measures serum or plasma level of serotonin. We have found that the patients with autism have abnormal level of serotonin, which should be tested before administering the treatment with selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) therapy. Elevated serotonin level in autism might also be related to autoimmune reaction to serotonin receptors in the brain (21).
• Mercury-induced autoimmune markers: This test assays for autoimmune reaction to mercury (or heavy metals) exposure. These markers include antinuclear antibodies against nucleolar antigens and antilaminin antibodies against basement-membrane proteins. We have found that only a small number of autistic children are positive for these antibodies but the level of these antibodies did not differ significantly from the normal children (30).

Субјекти (пациенти) и лабораториски процедури во
нашето истражување

Subjects and Laboratory Procedures
in Our Research

Во нашето експериментно истражување проучувавме деца со аутизам, нормални деца, браќа или сестри на деца со аутизам, деца со други болести, а ретко и возрасни. Во истражувањето единствено вклучивме деца со аутизам со цврста дијагноза на аутизам, а ги исклучивме другите дијагнози, како што се: первазивни развојни нарушувања (ПРН), первазивни развојни нарушувања-неспецифицирани на друг начин (ПРН-НДН) и Аспергеровиот синдром. Субјектите беа групирани според возраст и пол каде што беше можно, а никој не беше исклучен од учество во студијата поради фактор на раса, возраст или пол, освен оние што не беа цел на нашата истражувачка програма. Клиничката дијагноза на аутизмот беше битно направена според Дијагностички и статистички прирачник за ментални нарушувања, четврто издание (DSM-IV). Нормални деца беа оние што

In our experimental research, we studied autistic children, normal children, siblings of autistic children, children with other diseases and rarely adults also. In our research, we only included autistic children with a firm diagnosis of autism but excluded other diagnosis such as pervasive developmental disability (PDD), pervasive developmental disability-not otherwise specified (PDD-NOS), and Asperger’s syndrome. The subjects were matched for age and gender whenever possible but no one was denied participation in the study because of the race, age or gender factors, except those beyond the scope of our research program. The clinical diagnosis of autism was essentially according to the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition (DSM-IV). Normal children were those having a firm physical health without any sign of brain disease or mental illness or any other known medical condition. Before drawing blood samples of human subjects, we obtained proper permission of the Institutional Review Board (IRB) at Utah State University and formerly at the University of Michigan. By and large, we employed previously collected serum samples that were stored frozen in a freezer at –20oC while keeping the freezing-thawing cycle to a minimum. The details of various laboratory procedures and assay methods are described in our publications (3, 5, 7-9, 21, 23-25, 28, 30).

имаат цврсто физичко здравје без никаков знак на мозочна болест или, пак, ментална болест или некоја друга позната медицинска состојба. Пред да се земат примероци крв од лицата, обезбедивме соодветна дозвола од Институционалниот ревизиски одбор (ИРО) на Државниот универзитет во Јута и пред тоа од универзитетот во Мичиген. Сé на сé, ги искористивме претходно собраните серумски примероци складирани во замрзната состојба во замрзнувач на
-200 Ц, одржувајќи го циклусот на замрзнување и растопување на минимум. Деталите од различни лабораториски процедури и методи на анализа се опишани во нашите публикации (3, 5, 7-9, 21, 23-25, 28, 30).

Имуномодулациска терапија
(ИМТ) кај аутизмот

Immune Modulation Therapy
(IMT) in Autism

Лабораториските откритија јасно ја покажуваат улогата на автоимунитетот во патогенезата на аутизмот. Идејата дека аутизмот е автоимуно нарушување дополнително е зацврстена од фактот дека аутистичните пациенти реагираат добро на рехабилитацијата со имуномодулациските лекови (2, 3, 7, 19, 29). Имуно интервенциите може да предизвикаат имуномодулација - состојба на спречување или стимулација. Бидејќи аутистичните пациенти не покажуваат класична примарна имунодефициенција, не е добра стратегијата едноставно да зајакне нивниот имунитет. Сепак, тие, имаат имуноабнормалности и затоа, зависно од природата на имуноабнормалноста, целта на ИМТ треба да се нормализира или повторно да се воспостави имуната функција. Ова ќе дозволи побалансирана имунореакција, одбегнувајќи ги главните флуктуации на очигледната имуна активност, што може да биде штетна за пациентот. ИМТ секогаш треба да се дава во консултација со лекар, најдобро со клинички имунолог, алерголог или хематолог. Следниот список на имуномодулациските терапии (ИМТ) треба да се разгледаат кај аутизмот:

• Стероидна терапија: Стероидите, како што се Преднизон и/или ACTH вообичаено се употребуваат како прв лек при третманот на пациенти со автоимуни болести. Освен за извештаите за случаи што покажуваат позитивни реакции на стероиди (36), не се изведувале клинички обиди. А сепак, многу семејства даваат сопствени извештаи за клиничко подобрување на аутистичните карактеристики кога нивните деца примаат стероиди за медицински состојби поинакви од аутистичното нарушување.
•  Терапија со трансфер фактор: Трансферскиот фактор (ТФ) е имуно модулатор за контрола на клеточниот имунитет на Т-лимфоцитите, особено во текот на патогените инфекции. За да биде ефикасен, ТФ нормално се прави од леукоцити или од строго селектирани донатори на крв. Со користење на овој тип на ТФ, една отворена студија покажува клиничко подобрување на аутистичните симптоми кај некои деца (29). Исто така, постои комерцијален бренд на ТФ кој по дефиниција не е ТФ, туку е продукт на говедски колострум; неговото користење во лекувањето на аутистичните пациенти не е научно документирано.
• Имуноглобулинска терапија: Оваа метода за рехабилитација веќе се практикува за рехабилитација на аутистични пациенти со автоимуни проблеми. Отворени обиди на интравенозен имуноглобулин (IV-Ig) покажаа дека повеќето, но не сите deca со аутизам реагираат позитивно на овој третман (19). Клинички, така третираните деца покажаа подобрувања во јазикот, комуникацијата, социјалната интеракција и распон на внимание. Пред неколку години, го предложивме користењето на “Oral-Ig” како алтернативна метода на IV-Ig. Oral-Ig познато е дека дава значително подобрување на аутистичните симптоми кај САН-пациенти. Тој резултат е речиси ист како IV-Ig, или понекогаш дури и подобар од IV-Ig.
• Автоантигенска терапија: Рехабилитацијата на пациентите со автоимуни болести исто така, се реализира со орална примена на автоантигени. Ова, исто така, е применливо за аутизмот. Овој модалитет се потпира врз фактот дека аутизмот опфаќа автоимуна реакција на мозокот МБП. Ова откритие отвори тесен поглед кон можноста за рехабилитација на аутистични пациенти со додатоци во исхраната што содржат мозочен МБП или миелин, на пример: сфинголин (3).
• Глутатинска терапија: Глутатионот, трипептид што содржи три амино-киселини, е природен имуномодулатор, антиоксидант и детоксификатор. Заради овие три биолошки функции, глутатионот е најпотенцијален заштитник на телото од инфекции, автоимуни проблеми и други абнормалности, вклучувајќи го и оксидативниот стрес (37). Така, глутатионот се користи за рехабилитација на имунопроблеми кај deca со аутизам со клиничко подобрување.
• Плазмаферезиска терапија: Оваа процедура се користи за лекување на пациенти со инфекции, автоимуни болести и имунокомплексни болести. Додека процедурата успешно се користи за лекување на пациенти со невролошки нарушувања, како што се опсесивно-компулзивно нарушување (38). Таа досега не се користела за рехабилитација на пациенти со аутизам.

Laboratory findings clearly demonstrate the role of autoimmunity in the pathogenesis of autism. The idea that autism is an autoimmune disorder is further strengthened by the fact that autistic patients respond well to rehabilitation with immune modulating drugs (2, 3, 7, 19, 29). Immune interventions can produce immune modulation-a state of suppression or stimulation. Since autistic patients do not show a classical primary immunodeficiency, simply boosting their immunity is not a good strategy. However, they do have immune abnormalities and therefore depending on the nature of the immune abnormality the goal of IMT should be to normalize or reconstitute the immune function. This will permit a more balanced immune response, avoiding major fluctuations of overt immune activity, which could be detrimental to the patient. The IMT should always be given in consultation with a physician, preferably a clinical immunologist, allergist or hematologist.
The following list of immune modulation therapies (IMT) should be considered for autism:

• Steroid therapy: Steroids such as Prednisone and/or ACTH are commonly used as the first course of treatment for patients with autoimmune diseases. Except for case reports showing positive responses to steroids (36), the clinical trials have not been conducted. And yet many families anecdotally report clinical improvement of autistic characteristics when their children were given steroids for medical conditions other than the autistic disorder.
• Transfer factor therapy: Transfer factor (TF) is an immune modulator for controlling cellular immunity of T lymphocytes, especially during pathogenic infections. To be effective, TF is normally made from the leukocytes of highly select blood donors. By using this type of TF, an open-label study has shown clinical improvement of autistic symptoms in some children (29). Also, there is a commercial brand of TF which by definition is not a TF but simply a bovine colostrums product; its usefulness in treating autistic patients has not been scientifically documented.
• Immunoglobulin therapy: This approach to rehabilitation is already in practice for rehabbing autistic patients with autoimmune problems. Open-label trials of intravenous immunoglobulin (IV-Ig) have shown that most but not all autistic children respond favorably to this treatment (19). Clinically, children so treated have shown improvements in language, communication, social interaction and attention span. Several years ago, we suggested the use of “Oral-Ig” as an alternative approach to IV-Ig. The oral-Ig has now been shown to produce significant improvement of autistic symptoms in ASD patients, and the outcome is either about the same as IV-Ig or sometimes even better than the IV-Ig.
• Autoantigen therapy:Rehabilitation of patients with autoimmune diseases is also carried out by oral administration of autoantigens. This is also applicable to autism. This modality relies on the fact that autism involves autoimmune reaction to brain MBP. This finding has opened up a narrow window of opportunity for rehabbing autistic patients with nutritional supplements containing brain MBP or myelin, for example the sphingolin (3).
• Glutathione therapy:  Glutathione, a tripeptide containing three amino acids, is a natural immune modulator, antioxidant and detoxifier. Owing to these three biological functions, glutathione is the body’s most potent protector against infections, autoimmune problems and other abnormalities including oxidative stress (37). Thus glutathione has also been used to rehab immune problems in autistic children with clinical improvement.
• Plasmapheresis therapy: This procedure is used for managing patients with infections, autoimmune diseases and immune complex diseases. While the procedure has been successfully used to treat patients with neurological disorders such as obsessive-compulsive disorder (38) but it has so far not been used to rehab patients with autism.

Заклучоци

Conclusions

Нашето истражување покажа дека автоимунитетот е срцевина на проблемот кај мнозина пациенти со аутизам. Автоимуните абнормалности и реакцијата на пациентите на третаман со имуномодулациска терапија, ја зацврсти идејата дека аутизмот е автоимуно нарушување. Автоимуната реакција, најверојатно, е насочена кон миелинската обвивка на мозокот, а може исто така да бидат опфатени  и други неврални структури длабоко во мозокот. Неодамна откривме (8) дека nucleus caudatus е инволвиран во невропатологијата на аутизмот - ново откритие од потенцијално голема клиничка и терапевтска важност.

Our research has shown that autoimmunity is the core of the problem in many patients with autism. The existence of autoimmune abnormalities and the patient responsiveness to treatment with immune modulation therapy strengthens the idea that autism is an autoimmune disorder. Autoimmune response is most likely directed against myelin sheath in the brain but other neural structures deep in the brain might also be involved. We recently [8] found the involvement of caudate nucleus in the neuropathology of autism – a novel finding of potentially great clinical and therapeutic significance. The caudate nucleus is a very important brain center for controlling movement and cognitive processing, which are abnormal in autistic children. Since up to three-quarter of the autistic population has autoimmune problems, we think that a major proportion of autistic patients could benefit directly from autoimmunity research today. This subset is likely an “acquired” form triggered by a virus, possibly measles virus but other etiological factors should also be explored. In 2002, we designated this subset as an “Autoimmune Autistic Disorder (AAD)” – a term coined to describe the autoimmune subset of autism (39). We conclude that the autoimmunity research has a global impact for rehabbing autism worldwide hence the physicians and researchers should pay closer attention to autoimmunity research and immune modulation therapy in autism.

Nucleus caudatus е многу важен мозочен центар за контрола на движењето и когнитивното процесуирање, кои се абнормални кај децата со аутизам. Бидејќи три четвртини од аутистичната популација има автоимуни проблеми, мислиме дека најголем број аутистични пациенти би можеле директно да имаат полза од автоимуното истражување денес. Оваа подгрупа, веројатно, е “добиена" форма иницирана од вирус, веројатно од вирусот на морбилите, та треба да се испитаат и други етиолошки фактори. Во 2002 ја означивме оваа подгрупа како “Автоимуно аутистично нарушување (ААН)" - термин кој ја опишува автоимуната подгрупа на аутизам (39). Заклучивме дека истражувањата за автоимунитетот имаат глобален придонес за рахабилитација на аутизам во светот. Затоа докторите и истражувачите треба да му посветат повеќе внимание на автоимуното истражување и имуномодулациската терапија кај аутизмот.

Признание

Acknowledgments

Д-р Синг им искажува огромна благодарност на семејствата што учествуваа во неговото истражување. Тој би сакал да им заблагодари на неколкумина студенти и техничари за нивната помош во лабораториската работа. Неговото истражување беше поддржано без никаков конфликт на интереси со приватни грантови од Институтот за истражување на аутизмот, Фондацијата Dudley T. Aougherty, Фондацијата BHARE, Фондацијата Yorio и Фондацијата Forrest Lattner Jr.

Dr. Singh greatly appreciates the participation of families in his research. He would like to thanks several students and technicians for their assistance in laboratory work over the years. His research was supported without any conflict of interest by private grants from Autism Research Institute, Dudley T. Dougherty Foundation, BHARE Foundation, Yorio Foundation and Forrest Lattner Jr. Foundation.

Citation:Singh KV. Rehabilitation of Autism with Immune Modulation Therapy. J Spec Educ Rehab 2004; 5(3-4):161-178.

Литература / References  

1. Rimland B. Huge increase of autism incidence reported in California; autism cluster investigated in Brick, New Jersey. Autism Research Review International, 1999; 3: 1.
2. Singh VK. Immunotherapy for brain disease and mental illnesses. Progress in Drug Research 1997; 48: 129-146.
3. Singh VK. Neuro-immunopathogenesis in autism. Berczi I, Reginald M Gorczynski RM, eds. In: New Foundation of Biology, Netherlands: Elsevier BV Publishing, 2001; 1: 443-454.
4. Trottier G, Srivastava L, Walker CD. Etiology and infantile autism: a review of recent advances in genetic and neurobiological research. J. Psychiatry Neurosci., 1999; 24: 95-96.
5. Singh VK, Warren RP, Odell JD, Cole P, Warren L. Antibodies to myelin basic protein in children with autistic disorder. Brain, Behavior, and Immunity, 1993; 7: 97-103.
6. Vargas DL, Nascimbene C, Krishnan C, Zimmerman AW, Pardo CA. Neuroglial activation and neuroinflammation in the brain of patients with autism. Ann. Neurol., 2005; 57: 67-81.
7. Singh VK. Cytokine regulation in autism. Kronfol D, ed. In: Cytokines and mental health. Boston: Kluwer Academic Publishers, Boston, 2003; 369-383.
8. Singh VK, Lin SY, Yang VC. Serological association of measles virus and human herpesvirus-6 with brain autoantibodies in autism. Clin. Immunol. Immunopathol., 1998; 89: 105-108.
9. Singh VK, Jensen R. Elevated levels of measles antibodies in children with autism. Ped. Neurol., 2003; 28: 292-294.
10. Chess S, Fernandez P, Korn S, Behavioral consequences of congenital rubella. J. Pediatrics, 1978; 93: 699-703.
11. Stubbs EG, Ash E, Williams PS. Autism and congenital cytomegalovirus. J. Aut. Dev. Disord., 1984; 14: 183-89.
12. Ivarsson SA, Bjerre I, Vegfors P, Ashfors K. Autism as one of several disabilities in two children with congenital cytomegalovirus infection. Neuropediatrics, 1989; 21: 102-103. 
13. Trajkovski V. Autism, Faculty of Philosophy, Institute of Special Education and Rehabilitation, Skopje, 2004.
14. Warren RP, Singh VK, Averett RE, et al. Immunogenetic studies in autism and related disorders. Mol. Chem. Neuropathol., 1996; 28: 77-81.
15. Warren RP, Odell JD, Warren WL, et al. Strong association of the third hypervariable region of HLA-DRb1 with autism. J. Neuroimmunol., 1996; 67: 97-102. 
16. Warren RP, Foster A, Margaretten NC, et al. Immune abnormalities in patients with autism. J. Aut. Develop. Disord. 1986; 16: 189-197.
17. Singh VK, Fudenberg HH, Emerson D, Coleman M. Immunodiagnosis and immunotherapy in autistic children. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1988; 540: 602-604.
18. Menage P, Thibault G, Barthelemy C, et al. CD4+ CD45RA+ T lymphocyte deficiency in autistic children: effect of a pyridoxine-magnesium treatment. Brain Dysfunction 1992; 5: 326-333.
19. Gupta S, Aggarwal S, Heads C. Dysregulated immune system in children with autism: Beneficial effects of intravenous immune globulin on autistic characteristics. J. Aut. Develop. Dis. 1996; 26: 439-452.
20. Weizman A, Weizman R, Szekely GA, Wijsenbeek H, Livin E. Abnormal immune response to brain tissue antigen in the syndrome of autism. Am. J. Psychiat. 1982; 139: 1462-1465.

21. Singh VK, Lin XE, Newell E, Nelson C. Abnormal measles-mumps-rubella antibodies and CNS autoimmunity in children with autism. J. Biomed. Sci., 2002; 461: 359-364.
22. Comi AM, Zimmerman AW, Frye VH, Law PA, Peeden JN. Familial clustering of autoimmune disorders and evaluation of medical risk factors in autism. J. Child Neurol., 1999; 14: 388-394.
23. Singh VK, Warren RP, Averett R, Ghaziuddin M. Circulating autoantibodies to neuronal and glial filament proteins in autism. Ped. Neurol., 1997; 16: 88-90. 
24. Singh VK, Singh EA, Warren RP. Hyperserotoninemia and serotonin receptor antibodies in children with autism but not mental retardation. Biolog. Psychiat., 1997; 41: 753-755.
25. Singh VK, Rivas WH. Prevalence of serum antibodies to caudate nucleus in autistic children. Neurosci. Lett., 2004; 355: 53-64.
26. Singh VK, Warren RP, Odell JD, et al. Changes of soluble interleukin-2, interleukin-2-receptor, T8 antigen, and interleukin-1 in the serum of autistic children. Clin. Immunol. Immunopath., 1991; 61: 448-455.
27. Plioplys AV, Greaves A, Kazemi K, Silverman E. Lymphocyte function in autism and Rett syndrome. Neuropsychobiology, 1994; 29: 12-16.
28. Singh VK. Plasma increase of interleukin-12 and interferon-gamma: pathological significance in autism. J. Neuroimmunol. 1996; 66: 143-145.
29. Fudenberg HH. Dialyzable lymphocyte extract (DlyE) in ifantile onset autism: A pilot study. Biotherapy, 1996; 9: 143-147.
30. Singh VK, Rivas WH. Detection of antinuclear and antilaminin antibodies in autistic children who received thimerosal-containing vaccines. J. Biomed. Sci., 2004; 11: 607-610.
31. Madhur G. Indian scientists warn of “mutant measles” virus. Brit. Med. J., 2001; 322: 693.
32. Pabst HF, Spady DW, Carson MM, et al. Kinetics of immunologic responses after primary MMR vaccination. Vaccine, 1997; 15: 10-14.
33. Gupta S, Rimland B, Shilling PD. Pentoxifylline: brief review and rationale for its possible use in the treatment of autism. J. Child Neurol., 1996; 11: 501-504.
34. Liblau RS, Singer SM, McDevitt HO. Th1 and Th2 CD4+ cells in the pathogenesis of organ-specific diseases. Immunology Today, 1995; 16: 34-38.
35. Trinchieri G. Interleukin-12 and its role in the generation of TH1 cells. Immunology Today, 1993; 14: 335-338.
36. Buitelaar JK, van Engeland H, de Kogel CH, de Vries H, van Hooff J, van Ree J. The adrenocorticotrophic hormone (4-9) analog ORG 2766 benfits autistic children: report on a second controlled clinical trial. J. Am. Acad. Child Adolesc. Psychiatry, 1992; 31: 1149-1156.
37. Gutmann J. GSH your body’s most powerful protector glutathione. Montreal: Communications Kuda.ca, Inc., 2002: 240.
38. Singh VK. Autoimmunity and neurologic disorders. Latitudes, 1991; 4: 5-11.
39. Singh VK. Autoimmune autistic disorder (AAD). Invited presentation at the Defeat Autism Now (DAN) Think Tank Workshop; July 12-14, 2002.