ВОСПОСТАВУВАЊЕ НА ПАРАОКСОНАЗНАТА И АРИЛЕСТЕРАЗНАТА АКТИВНОСТ НА ПАРАОКСОНАЗА 1 (ПОН1) ВО ЗАВИСНОСТ ОД 55 (L/M) И 192 (Q/R) ДНК ПОЛИМОРФИЗАМ КАЈ ВОЗРАСНИТЕ ЛИЦА СО ДАУНОВ СИНДРОМ

Павел СИКОРА¹,
Ванда РЕПИСКА¹,
Мариа ШУСТРОВА²,
Лукач ХАЛЧАК³

Институт за медицинска биологија, генетика и клиничка генетика, Медицински факултет Коменски универзитет,
Братислава, Република Словачка¹,
Клиничка имунологија и алергологија, Програма за Даунов синдром; Словачки медицински универзитет,
Братислава, Република Словачка²,
Институт за медицинска биологија, биохемија и клиничка биохемија , Медицински факултет
Коменски универзитет,
Братислава, Република Словачка³

ESTABLISHMENT OF PARAOXONASE AND ARYLESTERASE ACTIVITY OF PARAOXONASE 1 (PON1) IN DEPENDENCE ON 55(L/M) AND 192(Q/R) DNA POLYMORPHISM IN ADULT PEOPLE WITH DOWN SYNDROME

Pavel SÝKORA¹,
Vanda REPISKÁ¹,
Mária SHUSTROVÁ²,
Lukách HALCHÁK³             

Institute of medical biology, genetic and clinical genetics, Faculty of Medicine Comenius University,
Bratislava, Slovak Republic¹,
Clinical immunology and allergology,
Down syndrome program;
Slovak Medical University,
Bratislava, Slovak Republic²,
Institute of medical chemistry, biochemistry and clinical biochemistry,
Faculty of Medicine
Comenius University,
Bratislava, Slovak Republic³

Примено: 12. 10. 2009
Прифатено: 30. 12. 2009
UDK: 616-056.7:575.224.232.3

Received: 12. 10. 2009
Accepted: 30. 12. 2009
Original article

Вовед

Introduction

Хуманиот серум параоксоназа 1 (ПОН1; ЕЦ 3.1.8.1) е калциум зависна естераза кој припаѓа на липопротеини со висока густина (HDL) (1). Таа хидролизира и инактивира многу органофосфати (ОФ) како што се параоксон, инсектицидите паратион и хлорпирифос, и нервните гасови самон и сарин. Лактоназата може да ги хидролизира дихидрокумаринот, хомоцистеинлактат и други лактати. Важен ефект на ПОН1 е инхибицијата на ЛДЛ пероксидацијата и хидролизата на оксидативните форми на фосфолипидите. Затоа, ПОН1 значително влијае врз развојот на атеросклерозата (2). Антиaтерoгенетскиот ефект беше потврден од страна на многу епигенетски, генетски и биохемиски студии, кои врз основа на експерименти со глувци забележале дека нема присуство на ПОН1 генот, дека гореспоменатите заштитни влијанија се состојат од можноста на ПОН1 да ја намали оксидативната модификација на липопротеинските честички (1-3).
ПОН1 генот лоциран на 7q21.3 (29 370 bp), има доминантна експресија во клетките на црниот дроб. Две општи СНП полиморфизми во кодоните на 55-Leu/Met (L/M) и 192-Qln/Arg (Q/R) биле детектирани во кодирачкиот регион на ПОН1 генот (3). Аминокиселинската супституција на позиција 192 резултира со појава на две изоформи, Q и R, кои се разликуваат во нивните хидролитички активности кон ОП оксони, Invitro, R изоформата ги хидролизира параоксоните (параоксоназната активност) се одвива многу побрзо за разлика од Q изоформата. R и Q изоформите го хидролизираат фенилацетатот („неполиморфен“) со иста фреквенција (4). ПОН1 активноста значително е засегната од индивидуалниот генотип за споменатиот кодирачки регион на полиморфизми со активна депресија со следниот редослед RR>QR>QQ на позиција 192 и LL>LM>MM на позиција 55 на полипептидниот синџир (5).
Лицата со Даунов синдром (ДС) се чини дека се „заштитени“ од развивање на атеросклероза. И покрај зголемувањето на оксидативниот стрес, не биле пронајдени разлики во параметрите на ЛДЛ оксидацијата помеѓу субјектите со ДС и контролната група (6). Интересно е дека, причините за смрт и патолошките истражување кај ДС не покажуваат зголемена фреквенција на кардиоваскуларни заболувања (7). Во спротивно, имаме намален број на коронарно артериски заболувања кај возрасните лица со ДС, и ретко овие пациенти умираат од атеросклерозни компликации. Настанатите промени беа полесни во однос на контролната група на иста возраст (9). 
Целта на оваа студија беше да се одреди параоксоназната и арилестеразната активност на ПОН1 во зависност од 55(L/M) и 192 (Q/R) ДНК полиморфизмот кај возрасните лица со ДС, и нивна споредба со контролната група изедначена по возраст и со тоа да укаже на различни мислења за експресијата на ПОН1 генот и намаленото ширење на коронарна болест кај субјектите со ДС. Втората цел е да се потврди in vitro влијанието на ДНК полиморфизмот врз активноста на ПОН1.

Human serum paraoxonase 1 (PON1; EC 3.1.8.1) is a calcium-dependent esterase located on high density lipoproteins (HDL) (1). It hydrolyses and inactivates many organophosphates (OP) such as paraoxon, the insecticides parathion and chlorpyrifos, and the nerve gases soman and sarin. It acts as a lactonase, being able to hydrolyse dihydrocumarin, homocysteinthiolactone and other lactones. An important effect of PON1 is the inhibition of LDL peroxidation and hydrolysis of oxide forms of phospholipides. Therefore, PON1 significantly affects the development of aterosclerosis (2). Its antiatherogenetic effect was confirmed by many epigenetic, genetic and biochemic studies based on experiments with knockout mice lacking PON1 which supposed that the protective influence mentioned above consists of PON1 ability to decrease oxidative modification of lipoprotein particles (1-3).
PON1 gene, located on 7q21.3 (29 370 bp), is predominantly expresed in hepatic cells. Two common SNP polymorphisms in codons 55-Leu/Met (L/M) and 192-Qln/Arg (Q/R) have been detected in the coding region of the PON1 gene (3). Amino acid substitution at position 192 results in  two isoforms, Q and R, which differ in their hydrolytic activity toward OP oxons. In vitro, the R isoform hydrolyses paraoxon (paraoxonase activity) more rapidly than the Q isoform. The R and Q isoforms hydrolyse phenylacetate (a „nonpolymorphic“ substrate)   at  about  the  same  rate  (4).  PON1
activity is therefore significantly affected by individual genotype for mentioned coding region polymorphisms with activity depression in order RR>QR>QQ at position 192 and LL>LM>MM at position 55 of the polypeptide chain (5).
People with Down syndrome (DS) appear to be „protected“ from the development of atherosclerosis. Despite the proven increase of oxidative stress, no differences were found in parameters of LDL oxidation between subjects with DS and control individuals (6). Interestingly, mortality causes and pathological findings in DS show no increased frequency of cardiovascular diseases (7). In contrast, a low prevalence of coronary artery disease is usually observed in adult subjects with DS, and these patients rarely die due to atherosclerotic complications (8). Even though the coronary arteries are not completely free of atherosclerosis, the alterations were milder than in control subjects of the same age (9).
The aim of this study was to determine the paraoxonase and arylesterase PON1 activity in dependance on 55(L/M) and 192 (Q/R) DNA polymorphism in adult subjects with DS, compared with a control group of the same age, and thereby contribute to the elucidation of different opinions on PON1 gene expression and the decreased prevalence of coronary disease in DS subjects. The second goal was to confirm in vitro the influence of DNA polymorphism on PON1 activity.

Материјали и методи

Materials and methods

Примероците на вкупната количина на крв (2,5 ml) и на серумот (1 ml) беа добиени од пациентите со Даунов синдром од клиничката канцеларија на СЗУ во Братислава. Групата на лица со ДС се состоеше од мажи (n=10) и жени (n=10) на возраст од 16 до 37 годишна возраст. Контролната група (10 мажи и 10 жени) главно се состоеше од нивните браќа и сестри кои беа приближно на иста возраст. Примените примероци беа складирани во оптимални услови се до нивната следна примена (2,5мл EDTA крв на -25°C и крвниот серум на -80°C).
ДНК беше изолирана од сите примероци на крв со помош на Qiagen ДНК mini kit. ПОН1 полиморфизмот беше детерминиран со полимеразна верижна реакција и анализа на должински полиморфизам на рестрикциски фрагменти (PCR-RFLP). PCR условите беа 2,5 µl единици ДНК, 0,5 µM од секој донор (BioTez Berlin-Buch GmbH) (3, 11) и 12,5 µl GoTaq Green Master Mix (Promega) содржи 2x Green GoTaq реакциски пуфер (pH 8,5), 400 µM од секоја dNTP и 3 mM MgCl2, со вкупен реактивен волумен од 25 µl. PCR продуктите беа дигестирани со AlwI (192Q/R) и NlaIII (55L/M) рестрикциски ендонуклеази (New England Biolabs). Ограничувањето на фрагменти биле разделени со електрофореза со агарозен гел. Начин и определување на фрагментните ограничувања на должината беше спроведена со УВ трансилуминација и ДНК скала (таб.1).
NaCl – стимулација и основните (не стимулирани) параоксоназни активности беа одредувани со помош на спектрометрија. Концентрацијата на параоксон (O,O-diethyl O-(4-nitrophenyl) phosphate) производи на хидролиза, диетилфосфат и p-нитрофенол, беа мерени со спектрометрија на 412 nm (10). Стимулираните и нестимулираните параксоназни активности на ПОН1 беа одредувани преку користење на 1,0 mM раствор на параксон (сигма). Во реакција смесата содржи раствор од 50 mM Tris. (pH 8,0; содржи 1,0 mm CaCl2.2H2O раствор за не-стимулираните активности и 1,0 mМ CaCl2.2H2O раствор со 1,0 М NaCl раствор за да стимулираат активност) и 40x разреден крвен серум.
Арилестеразната активност беше одредена преку спектрометриски мерења на хидролиза на производи на фенилацетатите (C8H802), оцетна киселина и концентрација на фенол од кои е можно спектрометриски да се измери на 270 nm (11). ПОН1 арилестеразната активност беше заснована врз употреба на 5 mM раствор на фенилацетат (Сигма), во истата реакциона смеса како и кај нестимулираните параоксоназни активности, само разликата е во тоа што конечното разредување на крвниот серум беше 800x.

All (whole) blood (2.5 ml) and serum (1 ml) samples were obtained from patients from Down syndrome program clinical office SZU, Bratislava. The group with DS consisted of men (n=10) and women (n=10) aged 16 to 37. The control group (10 men and 10 women) primarily consisted of their siblings of approximately the same age. Acquired samples were stored in optimal conditions until next utilization (2.5 ml EDTA blood at -25°C and blood serum at -80°C). 
DNA was extracted from all the (whole) blood using Qiagen DNA mini kit. PON1 polymorphisms were determined by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis. PCR conditions were 2.5 µl template DNA, 0.5 µM of each primer (BioTez Berlin-Buch GmbH) (3, 11) and 12.5 µl GoTaq Green Master Mix (Promega) containing 2x Green GoTaq Reaction Buffer (pH 8.5), 400 µM of each dNTP and 3 mM MgCl2, in a reaction total volume 25 µl. The PCR product was digested with AlwI (192Q/R) and NlaIII (55(L/M) restriction endonucleases (New England Biolabs). Restriction fragments were separated by agarose gel electrophoresis. Visualisation and determination of restriction fragments’s length was carried out using UV transillumination and DNA ladder (tab. 1).
The NaCl-stimulated and basal (non-stimulated) paraoxonase activities were determined by spectrophotometry. Concentration of  paraoxon (O,O-diethyl O-(4-nitrophenyl) phosphate) hydrolysis products, diethylphosphate and p-nitrophenol, was measured spectrophotometrically at 412 nm (10). Stimulated and non-stimulated paraoxonase PON1 activities were determined using 1.0 mM paraoxon solution (Sigma), in a reaction mixture containing 50 mM Tris solution (pH 8.0; containing 1.0 mM CaCl2.2H2O solution for non-stimulated activity and 1.0 mM CaCl2.2H2O solution with 1.0 M NaCl solution for stimulated activity) and 40x diluted blood serum.
The arylesterase activity was determined by spectrophotometric measurement of hydrolysis products of phenylacetate (C8H802), acetic acid and phenol the concentration of which is possible to measure spectrophotometricaly at 270 nm (11). PON1 arylesterase activity was established using 5 mM phenylacetate solution (Sigma), in the  same reaction mixture such as  non-stimulated paraoxonase activity, the only difference being that the final dilution of blood serum was 800x.

Табела 1. ДНК протокол за анализа

Table 1. DNA analysis protocol

Резултати

Results

Забележавме значително намалување на стимулираната параоксоназна активност (p=0,019; сл.1) кај субјектите со ДС (n=6) во споредба со контролната група (n=11) во првата група (RR//LL или QR/LL). Вредностите на нестимулираните параоксоназни и арилестеразни активности, исто така беа пониски за лицата со ДС, меѓутоа намалувањето не беше значително (p>0,05).
Во втората (со среден генотип) група, не воочивме значително намалување на активностите на параоксоназата и арилестеразата (субјекти со ДС, n=12) во споредба со контролната група (n=7) (p>0,05; фиг.2). Овие откритија може да бидат поврзани со многу мал број на субјекти во оваа група.
Го воочивме QQ/MM полиморфизмот („слабиот генотип“) само кај еден од субјектите со ДС и во еден од контролните субјекти и токму поради тоа, најденото намалување на активноста на параоксоназата и ариестеразата не може да биде статистички анализирана (таб.2).

We have observed a significant decrease of stimulated paraoxonase activity (p=0.019; fig.1) in subjects with DS (n=6) in comparison to the control group (n=11) in the first group (RR//LL or QR/LL). The values of non-stimulated paraoxonase and arylesterase activities were lower for subjects with DS as well, but the decrease was not of any significance (p>0.05).
In the  second (middle genotype) group („middle genotype“), no significant decrease in paraoxonase and arylesterase activities has been observed (subjects with DS, n=12) in comparison to the control group (n=7) (p>0.05; fig.2). This finding may be related to a very small number of subjects in this group.
We have detected the QQ/MM polymorphism („weak genotype“) only in one of the subjects with DS and in one control subject, and therefore the found decrease of paraoxonase and arylesterase activity could not be statistically analysed (tab.2).